对于做“试管婴儿”的患者,他们的胚胎要在体外培养3到6天,然后胚胎学家门会筛选最佳的胚胎进行移植或冷冻。那么胚胎学家是通过什么方法、以什么标准来进行胚胎筛选呢?
所谓“最佳”的胚胎就是指最具有植入子宫内膜和发育成胎儿潜能的胚胎,这也是胚胎学家们筛选胚胎的目标,所有的标准也均是围绕这一目标。现阶段在胚胎实验室中常规的,也是金标准的筛选方法还是胚胎形态学观察,也就是直接通过显微镜观察胚胎的形态特征。
具体流程如下:首先在取卵日当天对卵子进行授精,在授精后4到6小时观察第二极体是否排出,以预测该卵子是否受精,及时补救;然后在授精后16到18小时观察原核的有无,双原核的出现才是卵子正常受精的标志,与此同时也对受精卵的胞质情况进行观察;胚胎在授精后27小时左右分裂为两个卵裂球,43到45小时分裂为四细胞,67到69小时分裂为八细胞,因此在授精后第三天会再次观察,对胚胎细胞数量和质量进行评价;胚胎继续培养到授精后106到108小时开始形成囊胚,所以对于养囊胚的胚胎会在授精后第五天和第六天观察囊胚的发育情况,评价囊胚质量。
1. 原核期胚胎评估标准此阶段观察的目的是判断卵子是否正常受精,以及预估受精卵的发育潜力。第一极体的出现是卵子成熟的标志,而第二极体的出现则预测卵子成功受精,当然双原核的出现才是卵子正常受精的标志,只有一个原核或两个以上的原核都表明卵子是异常受精的状态,没有原核则有可能是受精失败。除此之外,受精卵的胞质均匀也是其具有较高发育种植潜能的标志,胞质不均、有粗颗粒区、有滑面内质网(SER)池、有空泡等现象,对胚胎发育质量都有不良影响,甚至影响到胚胎着床和妊娠。
2. 卵裂期胚胎评估标准此阶段观察的目的是评价胚胎的发育情况,筛选发育优良、最具植入潜能的胚胎用来移植或冷冻后以备下次移植,还有评价胚胎体外发育成囊胚的潜力。胚胎的分裂与发育速度是胚胎正常发育的关键因素,与种植潜能也密切相关,卵裂速度过快或过慢均提示胚胎发育受损,授精后第三天卵裂球(细胞)数目为7~9个的胚胎,具有较高的囊胚形成率,种植潜能也较高,所以细胞数目是评价胚胎发育质量的标准之一;其次,每个细胞的发育情况也是衡量胚胎整体发育水平的标准,所以也需对细胞大小的均匀性、细胞碎片的多少等进行统计;综上,结合细胞数量、碎片比率、均一程度等,将胚胎分级,1级最好,4级最差。
3. 囊胚评估标准此阶段观察的目的是评价囊胚的发育情况,筛选发育优良、最具植入潜能的囊胚用来移植或冷冻后以备下次移植。囊胚的形态与妊娠率和种植率都直接相关,评价囊胚的形态主要从三个方面:囊胚的扩张程度(囊胚腔的大小)、内细胞团的细胞质量、滋养外胚层的细胞质量。根据囊胚腔的大小及孵化与否,将囊胚分为六个时期,1期为早期,囊胚腔小于胚胎总体积1/2;4期囊胚腔完全充满胚胎,授精后第五天的胚胎就应该发育到这一阶段;到6期的囊胚则已完全从透明带中逸出。根据内细胞团的大小和质量,由高到低会将其分为A、B、C三个级别,同理滋养外胚层也被分为A、B、C三级,所以在第5天最好的囊胚就被评为4AA。
传统的形态学观察方法是在特定的时间点对胚胎进行观察,结合各个时间点的观察结果综合评价胚胎质量,从而筛选优质胚胎进行移植和冷冻。但是胚胎发育是动态的、变化的过程,需要进行多次观察,观察次数越多越接近胚胎的真实情况,观察次数越多对胚胎的扰动也越多,反而影响到胚胎发育。因此,需要在全面观察胚胎发育动态与减少对胚胎的干扰间找到平衡,于是出现了时差成像系统和形态动力学评估模型。
时差成像系统(Time-lapse)是在培养箱内安装内置摄像装置,对每一枚胚胎每间隔一段时间进行自动摄像,实现了在稳定可控的环境中对胚胎的实时观察,避免了对胚胎的反复干扰。通过对胚胎发育过程中的连续拍摄,可以记录胚胎各个关键变化的发生时间点、持续时间、变化形式等,例如什么时间出现了两个原核,出现多久消失了,什么时间第一次分裂,是一分为二还是一分为三等等,再将获得的胚胎发育的形态动力学信息与评估模型的参数比对,从而对胚胎的发育水平、种植潜能进行评估和预测,辅助胚胎学家对胚胎的筛选。尽管这一新技术具有诸多优势,但时差成像系统价格昂贵,尚未得以广泛应用,形态动力学评估模型也有待临床研究的进一步验证和明确。
胚胎的发育潜能同样与染色体的非整倍性及基因异常密切相关,然而染色体异常的胚胎在早期发育中可具有与正常胚胎同样好的形态,仅从形态学上并不能反映出染色体的异常。针对这一问题,第三代试管婴儿,即胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)技术是解决方法之一,也是胚胎学家们筛选胚胎的辅助方法。通过取出囊胚滋养外胚层三五个细胞,送去进行遗传检测,检测染色体的种类、数目是否正常,检测是否携带遗传疾病的基因,从而筛选出染色体正常、基因正常的胚胎用于移植,提高妊娠率,避免生出患先天疾病的孩子。但是PGD/PGS技术还是存在着一定局限,由于遗传检测需要一定时间,所以需要将胚胎冷冻以待检测结果;再者需要取出部分细胞,对胚胎还是有创的。
传统的形态学观察方法很难避免观察者的主观因素,时差成像系统和胚胎植入前遗传学诊断/筛查也都存在各自的局限性,那么是否有一种客观的、无创的、准确的方法来评价胚胎发育潜能呢?作为优质胚胎的理想状态应该是,从基因组学反应出胚胎DNA完整性和染色体结构,到转录组学反映出RNA结构和功能,到蛋白组学反映出胚胎基因表达情况,到代谢组学反应出细胞功能均正常。这种从基因结构、表达到细胞功能均正常的胚胎才具有最高的种植潜能。因此,胚胎学家们一直都在致力于探索这种评估方法。如今,已经出现了诸多针对胚胎相关细胞(卵丘细胞、颗粒细胞等)、胚胎相关液体(卵泡液、培养液等)中各种成分的种类、含量变化的研究,尽管这些研究成果还不充分、还不能广泛应用到临床实践中,但在不久的将来,这些研究定能促成客观准确评价胚胎发育潜能的评估方法。
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